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Communications Biology volume 5, Numéro d'article : 1206 (2022) Citer cet article 3909 Accès aux détails de 4 Altmetric Metrics Analyse de la phosphorylation par agoniste des récepteurs couplés aux protéines G

Biologie des communications volume 5, Numéro d'article : 1206 (2022) Citer cet article

3909 Accès

4 Altmétrique

Détails des métriques

L'analyse de la phosphorylation induite par les agonistes des récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) peut fournir des informations précieuses sur l'état d'activation des récepteurs et la pharmacologie du ligand. Cependant, à ce jour, l’évaluation de la phosphorylation des GPCR à l’aide d’applications à haut débit s’est révélée difficile. Nous avons développé et validé un test immunologique à base de billes pour l'évaluation quantitative de la phosphorylation du GPCR induite par un agoniste, qui peut être entièrement réalisé dans des plaques de culture cellulaire multipuits. Le test implique l'immunoprécipitation de récepteurs marqués par affinité à l'aide de billes magnétiques, suivie d'une détection de protéines à l'aide d'anticorps anti-GPCR spécifiques à l'état de phosphorylation et indépendants de l'état de phosphorylation. À titre de preuve de concept, cinq GPCR prototypiques (MOP, C5a1, D1, SST2, CB2) ont été traités avec différents agonisants et antagonistes, et des courbes concentration-réponse ont été générées. Nous avons ensuite étendu notre approche pour établir des tests d'inhibiteurs cellulaires sélectifs de la GPCR kinase (GRK), ce qui a conduit à l'identification rapide d'un inhibiteur sélectif de GRK5/6 (LDC8988) et d'un inhibiteur pan-GRK très puissant (LDC9728). En conclusion, ce test polyvalent de phosphorylation de GPCR peut être largement utilisé pour le profilage des ligands et le criblage des inhibiteurs.

Les récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) sont des transducteurs de signaux vitaux qui médient les effets de divers stimuli chimiques et physiques et représentent des cibles médicamenteuses majeures pour de nombreuses maladies humaines. Les GPCR ont une structure uniforme avec sept domaines transmembranaires et sont donc également appelés récepteurs à sept transmembranaires (7TMR). L'activation par leurs ligands endogènes ou leurs agonisants exogènes entraîne des changements de conformation des GPCR qui sont reconnus par une famille de kinases appelées récepteurs kinases couplés aux protéines G (GRK)1. La capacité unique des GRK à reconnaître les récepteurs activés entraîne une phosphorylation dépendante de l'agoniste au niveau des résidus intracellulaires de sérine et de thréonine 2,3. De plus, les kinases régulées par des seconds messagers peuvent également participer à la phosphorylation des GPCR, notamment les protéines kinases A et C et d'autres sérine/thréonine kinases4,5,6. La phosphorylation des GPCR est un processus biologiquement et pharmacologiquement important qui initie principalement la désensibilisation et l'intériorisation d'un récepteur7,8. La phosphorylation augmente également l’interaction des GPCR avec des protéines adaptatrices intracellulaires telles que les β-arrestines, ce qui peut déclencher une deuxième vague de signalisation9,10,11,12.

Les premières études GPCR étaient basées sur des tests radioactifs de phosphorylation de cellules entières, qui nécessitent des niveaux élevés de radioactivité et ne peuvent pas être utilisés pour identifier des résidus de sérine et de thréonine phosphorylés individuels. Plus tard, des études ont été orientées vers l’analyse phosphoprotéomique, grâce à laquelle des informations quantitatives limitées ont été obtenues13. Actuellement, l’approche dominante repose sur des anticorps qui reconnaissent spécifiquement l’état phosphorylé d’un GPCR14,15,16,17,18. Lorsqu’ils sont disponibles, les anticorps anti-GPCR spécifiques au phosphosite sont d’excellents outils pour résoudre la dynamique temporelle et spatiale de la phosphorylation des récepteurs, identifier les kinases et phosphatases pertinentes, détecter l’activation des récepteurs et profiler les propriétés pharmacologiques de nouveaux ligands19,20,21,22. Cependant, les anticorps spécifiques au phosphosite sont principalement utilisés dans des approches d’immunotransfert qui sont techniquement difficiles, limitées à de petites tailles d’échantillons et difficiles à quantifier.

Dans la recherche pharmaceutique et universitaire, des analyses à haut débit sont souvent nécessaires pour faciliter le criblage de grandes chimiothèques. Bien que la liaison au récepteur, la signalisation de la protéine G et le recrutement de l'arrestine puissent être évalués avec les méthodologies disponibles, les technologies adéquates pour la détermination de la phosphorylation des GPCR ne sont actuellement pas disponibles. Nous étions donc motivés à tirer parti des anticorps anti-GPCR spécifiques au phosphosite dans le développement d'un test immunologique de phosphorylation quantitative pouvant être entièrement réalisé dans des plaques de culture cellulaire multipuits et propice aux applications à débit moyen à élevé (Fig. 1). Étant donné que ce test peut être adapté à pratiquement tous les récepteurs sept transmembranaires, il est appelé « test de phosphorylation 7TM ».

95% confluency. The cells were cultured in the presence or absence of the agonist [D-Ala2,N-MePhe4,Gly-ol]-enkephalin (DAMGO) and then lysed in detergent buffer containing protease and protein phosphatase (PPase) inhibitors. After plate centrifugation, lysates were transferred to U-bottom 96-well plates. MOPs were then immunoprecipitated using mouse anti-HA antibody-coated magnetic beads. After washing the beads under magnetic force, either phosphosite-specific rabbit antibodies that specifically recognized the S375-phosphorylated form of MOP (pS375-MOP) or antibodies that detected MOP in a phosphorylation-independent manner (np-MOP) were added to the cells (Fig. 2a). Primary antibody binding was then detected using commercially available enzyme-labeled secondary antibodies followed by addition of the respective enzyme substrate solution. The color reaction in DAMGO-treated wells was stopped when the optical density (OD) read at 405 nm reached 1.2, typically within 2 to 8 min. Under identical conditions, the OD of untreated wells was approximately 0.2, suggesting that DAMGO-induced S375 phosphorylation of MOP was specifically detected within the optimal dynamic range for 2′-azino-bis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid (ABTS)-based enzyme immunoassay substrates (Fig. 2b). Omission of the magnetic beads or the primary or secondary antibodies or the use of untransfected cells resulted in OD readings of 0.2 or less. When DAMGO was added at different concentrations ranging from 10 nM to 10 µM in wells assayed using the anti-pS375-MOP antibody, we observed increasing OD readings with data points following the typical shape of a sigmoidal concentration–response curve (Fig. 2c). In contrast, all wells assayed using the anti-np-MOP antibody yielded an OD reading of ~0.8, independent of agonist exposure, indicating that all the MOPs had been identified (Fig. 2c). Next, we evaluated the effect of PPase inhibitors with both a pS375-MOP phosphorylation immunoassay and western blot assay with cells cultured in a multiwell plate. For the western blot analysis, cells were cultured and treated in 96-well plates as described and lysed in detergent buffer with or without PPase inhibitors. MOPs were immunoprecipitated with anti-HA magnetic beads. Immunoprecipitates were washed under magnetic force, and receptors were eluted from the beads into SDS-sample buffer by incubating the plates for 25 min at 43 °C. When these samples were immunoblotted with the anti-pS375-MOP antibody, a concentration-dependent increase in S375 phosphorylation was observed in samples cultured with PPase inhibitors but not in samples lysed without PPase inhibitors (Fig. 2d, top panel). When the blot was stripped and reprobed with the np-MOP antibody, similar levels of MOPs were detected in all the samples irrespective of the presence of PPase inhibitors or agonist exposure (Fig. 2d, bottom panel). For the in-well assay, cells were plated and grown, treated and lysed as in the western blot assay, except that the samples were directly immunoassayed in the plate. Similar to the results obtained by immunoblotting, the results of the assay performed with the anti-pS375-MOP antibody revealed a concentration-dependent increase in signal intensity only in the wells with PPase inhibitor-treated samples (Fig. 2e). In contrast, in wells assayed with the anti-np-MOP antibody, similar signals were observed independent of inhibitor or agonist treatment (Fig. 2f). Notably, a high degree of correlation between the concentration–response curves obtained through the immunoblot analysis and immunoassay was found (Supplementary Fig. 1). These results show that the addition of PPase inhibitors during cell lysis was an essential component of the assay. These results also show that anti-pS375-MOP antibody binding depended on agonist-induced receptor phosphorylation, which needed to be protected from PPase digestion during cell lysis. The anti-np-MOP antibody bound to receptors regardless of their phosphorylation status, and hence, using this antibody appeared to be a feasible means of controlling total receptor content./p>